Определение концентрации билирубина в сыворотке крови новорожденных
Актуальность проблемы
Билирубин – это оранжево-желтый пигмент, который образуется при разрушении стареющих эритроцитов и выводится с желчью, поэтому еще он называется желчным пигментом. Он был обнаружен R. Virchow в 1849 г. и назван «желтым» пигментом «гематоином». Термин «билирубин» был предложен StadelerStadeler в 1864 г. Образуется билирубин из гемоглобина – соединения железа с белком, которое составляет основу эритроцита.
Когда эритроциты, красные кровяные тельца крови, стареют и распадаются, из гемоглобина образуется так называемый непрямой или свободный билирубин; этот процесс происходит в клетках селезенки, костного мозга и печени. Свободный билирубин высоко токсичен, поскольку он липофилен и практически нерастворим в воде, потому он легко растворяется в липидах мембран, проникает в мембраны митохондрий и нарушает метаболические процессы в клетках. Свободный билирубин ингибирует активность митохондриальных ферментов, нарушает синтез ДНК, блокирует синтез белка и процессы фосфорилирования; замедляет поглощение тирозина и блокирует работу ионных каналов, что нарушает процессы синаптической передачи и нервной проводимости; ингибирует ионный обмен и транспорт воды в почке, и т.п., что, в итоге, приводит к развитию билирубиновой энцефалопатии.
В крови свободный билирубин связывается с альбумином и транспортируется в печень. В гепатоцитах, клетках печени, билирубин под воздействием фермента глюкуронилтрансферазы связывается с глюкуроновой кислотой, образуя связанный или прямой билирубин (моно- и диглюкуронид билирубина), который хорошо растворим в воде и мало токсичен. Связанный билирубин экскретируется в желчь и затем поступает с желчью в кишечник, где распадается и под действием кишечной микрофлоры превращается в соединения, основная часть которых выводится с калом (стеркобилин), а незначительная часть – с мочой (уробилин).
Изменение уровня билирубина говорит о наличии серьезных заболеваний в организме. Повышенный билирубин накапливается в крови и по достижении определенной концентрации проникает в ткани, окрашивая их в желтый цвет. Этот состояние называется гипербилирубинемией или желтухой.
Желтуха периода новорожденности, обусловленная накоплением в крови избыточного количества билирубина, встречается часто и иногда требует проведения неотложных лечебных мероприятий. По различным данным, на первой неделе жизни желтуха встречается у 25–50% доношенных и у 70–90% недоношенных новорожденных.
У новорожденных детей в первую неделю жизни наблюдается так называемая физиологическая желтуха, вызванная повышением общего билирубина крови за счёт фракции свободного билирубина. Физиологическая желтуха связана с усиленным разрушением эритроцитов при еще несовершенной работе билирубин-конъюгирующей системы.
Но желтуха новорожденных может быть и патологической, в том числе конъюгационной (причина заключается в ферментной недостаточности печени); гемолитической (связанной с проблемами крови, например, с изменением строения гемоглобина или эритроцитов); печеночной (паренхиматозной, возникающей при различных заболеваниях печени); механической (обтурационной, развивающейся при нарушении нормального оттока желчи).
Опасность желтух заключается в том, что свободный билирубин является нейротоксическим ядом и при определенных условиях (недоношенность, гипоксия, гипогликемия, длительная экспозиция и т. д.) вызывает специфическое поражение подкорковых ядер и коры головного мозга — так называемую билирубиновую энцефалопатию, которая встречается исключительно в период новорождённости и ведёт к развитию глубокой умственной отсталости и детского церебрального паралича (ДЦП). Степень токсического влияния билирубина в основном зависит от его концентрации в тканях мозга и продолжительности гипербилирубинемии.
Неонатальная желтуха, регистрируемая в России по статистической форме №32 лишь с 1999 года, занимает третье место по показателям заболеваемости у новорожденных после гипоксии (98,1‰), замедления роста и недостаточности питания (87,0‰), ее частота составила 77,1‰ в 2010 году (69,0‰ в 2002 году, по данным Сухановой Л.П., ФГУ ЦНИИОИЗ Минздравсоцразвития РФ, 2012).
К сожалению, как видно из приведенных данных, в последние годы отмечается увеличение частоты неонатальных желтух, прежде всего, конъюгационной (чаще встречается у недоношенных детей), а также гемолитической. Также все чаще звучит проблема так называемой затяжной желтухи, выявляемой у детей старше 1 месяца жизни. Сведения о роли различных этиологических факторов, способствующих увеличению частоты неонатальных желтух, в литературных источниках весьма разрозненны. По некоторым данным, этому способствует увеличение числа недоношенных детей, новорожденных с задержкой внутриутробного развития, с морфо-функциональной незрелостью, перенесших острую или хроническую гипоксию, рожденных от матерей с эндокринной и другой соматической патологией; по другим сведениям, росту частоты неонатальных желтух способствовало введение в национальный календарь прививок вакцинации от гепатита В в первые сутки жизни. Вероятно, определенный вклад в увеличение частоты неонатальных желтух вносят: увеличение числа детей с внутриутробными инфекциями (прежде всего, гепатитами), увеличение частоты иммуноконфликтной беременности, прием матерью во время беременности медикаментов, влияющих на созревание гепатобилиарной системы плода, нарушения экологии питьевой воды и питания беременных женщин.
Медицинский работник, наблюдающий ребёнка, должен уметь оценить индивидуальный «безопасный уровень» билирубина у новорождённого с желтухой и предвидеть его возможное нарастание. Врачу-педиатру необходимо знание основных особенностей билирубинового обмена у новорожденных, клинических и лабораторных критериев физиологической и патологических желтух, чтобы своевременно выявить отклонения от «нормального» течения неонатальной желтухи и решить вопрос о необходимости амбулаторного или стационарного обследования и лечения. Согласно учебному пособию «Желтухи у новорожденных и детей раннего возраста», Пушкарева Ю.Э., 2009, желтуха – визуальное проявление гипербилирубинемии, которое отмечается у доношенных детей при уровне билирубина более 68 мкмоль/л, у недоношенных - более 120 мкмоль/л. На 3-й день и до конца недели считается, что значения до 205 мкмоль/л билирубина у новорожденных – норма. У недоношенных детей эта цифра чуть ниже – до 170 мкмоль/л. В дальнейшем концентрация билирубина понижается и симптомы желтухи снижаются до нормы. Через три-две недели норма билирубина у новорожденных не должна быть выше 8,5–20,5 мкмоль/л, как и у взрослых. Если концентрация билирубина в первые три недели жизни превышает у доношенных детей 256 мкмоль/л, а у недоношенных 172 мкмоль/л, то это рассматривается как патологическое состояние.
Таким образом, точное количественное определение концентрации билирубина в сыворотке крови новорожденных требует пристального медицинского контроля и является актуальной задачей современного здравоохранения. Надежными и современными приборами для определения билирубина должны быть оснащены все родильные дома, перинатальные центры и отделения для новорожденных и недоношенных детей детских больниц.
Определение билирубина: методы и приборы
Актуальность определения билирубина обусловила развитие и постоянного совершенствование методов надежного определения его концентрации. Реакция между билирубином и диазотированной сульфаниловой кислотой, открытая Эрлихом в 1883 г., была использована для определения билирубина в сыворотке и желчи Bergh и Muller в 1916 г. В последующем данная реакция, получившая название «реакция Ван ден Берга», послужила основой для развития методов определения билирубина.
Появление понятий «прямой» и «непрямой» билирубин связано с обнаружением того факта, что в сыворотке новорожденных с желтухой эта реакция протекала медленно и требовала добавления этанола, а в желчи и сыворотке взрослых реакция без спирта протекала быстро. В 1950-е годы с помощью хроматографии было установлено, что не прямо реагирующая фракция билирубина – это свободный билирубин.
Один из старых методов определения билирубина был основан на определении оксида углерода в выдыхаемом воздухе, поскольку оксид углерода и билирубин при расщеплении гема образуются в эквимолярных количествах. Концентрацию оксида углерода в выдыхаемом воздухе определяли как у новорожденных, так и у взрослых.
Для исследования общего билирубина и его фракций в современной биохимии могут применяться такие методы как:
- прямые спектрофотометрические методы, основанные на измерении абсорбции билирубина при 440-460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;
- ферментативные методы, основанные на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;
- колориметрические методы, базирующиеся на взаимодействии билирубина с диазотированой сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный – только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и др.), который высвобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания;
- электрохимические методы, использующие платиновый и ртутный электрод;
- хроматографические методы, позволяющие проводить разделение билирубина по фракциям;
- флюориметрические методы, использующие свойство свободного билирубина после поглощения испускать свет длиной 520 нм, что позволяет определить концентрацию неконъюгированного билирубина
При этом унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика-Клеггорна-Графа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.
Не вызывает сомнений, что с научной точки зрения, самым надежным является хроматографический метод, а также методы, основанные на реакции диазосочетания, но на практике необходимо учитывать тот факт, что билирубин как химическое соединение чрезвычайно нестабилен и разрушается при освещении и высокой температуре, поэтому исследуемые образцы должны быть защищены от воздействия окружающего света в ходе анализа. Например, концентрация билирубина может снизиться на 30–50% за 1 ч, если образец сыворотки или плазмы подвергают воздействию прямого солнечного света.
Таким образом важной и актуальной проблемой является проблема стандартизации методов и выбор надлежащего калибровочного материала, стандартных растворов.
Новым этапом развития быстрых методов определения билирубина стал неинвазивный подход для определения билирубина с помощью прибора, получившего название билирубинометр. Билирубинометр представляет собой отражательный фотометр, позволяющий по окраске кожных покровов судить о концентрации билирубина в крови.
Впервые об использовании транскутанного (чрескожного) метода анализа билирубина в клинической практике стало известно в 1980 году (Yamanouchi I., Transcutaneous bilirubinometry: preliminary studies of noninvasive transcutaneous bilirubin meter in the Okayama National Hospital. // Pediatrics, 1980; 65, 195-202) с появлением билирубинометра фирмы «Минолта». С тех пор на мировом рынке представлен ряд приборов с аналогичным принципом действия (Jaundice Meter JM-102, BiliCheck system, Dräger JM-103). Положительный опыт медицинского применения транскутанного билирубинометра фирмы «Минолта» обусловил разработку и серийное производство отечественного аналога - фотометрического анализатора гипербилирубинемии «Билитест» (типа АГФ-02). Прибор «Билитест» прошел в установленном порядке все необходимые испытания и был рекомендован к промышленному выпуску решением комиссии Минздрава СССР от 25 июня 1991 г. (ЗАО НПП «Техномедика»). Варианты исполнения прибора: Билитест и Билитест 2000.
Принцип работы этих портативных приборов для определения билирубина - использование света вместо иглы, без взятия крови. Производители акцентируют внимание на возможности измерения уровня билирубина при значительном снижении риска инфицирования или перекрестного загрязнения, поскольку до новорожденного дотрагивается только съемный пластиковый наконечник вместо иглы. Однако важно понимать, что транскутанная билирубинометрия базируется на сильной корреляционной связи содержания общего билирубина в подкожной жировой клетчатке (что проявляется пожелтением кожи) с содержанием билирубина в крови. На результат транскутанного измерения билирубина влияют динамика прокрашивания жировой клетчатки желтым пигментом и физические параметры кожи, особенно ее цвет, несмотря на то, что в приборах более поздних моделей использование нескольких длин волн должно было устранить нежелательный эффект окраски кожных покровов.
К важным преимуществам билирубинометров относится быстрое получение информации, они оказались весьма полезны в определении тактики лечения новорожденного с желтухой и облегчении наблюдения за новорожденными вне стационара. Есть данные, что некоторые семьи используют взятые напрокат неинвазивные билирубинометры для самостоятельного наблюдения за протеканием желтухи у детей в домашних условиях. Действительно, для одного ребенка, с уже установленным диагнозом транскутанным измерением в домашних условиях можно наблюдать динамику болезни, но важно понимать, что в случае использования транскутанных приборов речь о достоверной статистике, сравнении разных детей, идти не может. Кроме того, у новорожденных детей выраженность желтухи и скорость образования билирубина не всегда коррелируют, скорость выведения билирубина колеблется, а раннее выявление тех новорожденных, у которых образуются большие количества билирубина, является важным для профилактики энцефалопатии.
Определение транскутанового билирубинового индекса позволяет объектизировать степень выраженности желтухи. Этот метод является вспомогательным, его адекватное использование способствует уменьшению частоты взятия крови для определения уровня билирубина. Однако транскутанное определение степени желтушности не может заменить биохимический и прямой
фотометрический метод при решении вопроса о показаниях к проведению заменного переливания крови.
Поэтому ряд производителей обратили внимание на производство приборов, точно определяющих концентрацию билирубина в плазме крови.
Одним из таких приборов является билирубинометр Solar БФ-ЦН-01 (Республика Беларусь), определяющий уровень билирубина у новорожденных и взрослых пациентов методом двухволновой фотометрии в диапазоне от 0 до 600 мкмоль/л с погрешностью измерений 5% и объемом плазмы для исследований 25 мкл. Исследуемый материал должен быть размещен в кювете. Встроенный принтер или передача данных на компьютер не предусмотрены.
Билирубинометр UNISTAT (Reichert Technologies) – американский прибор, работающий с одноразовыми кюветами (объем образца 20 мкл), с точностью определения 5% в диапазоне концентраций от 0 до 30 мг/дл (10% выше 30 мг/дл).
Билимет К (ЗАО НПП «Техномедика») – портативный анализатор билирубина, основанный на двухволновой фотометрии плазмы крови в стеклянном капилляре. Забор крови производится в стеклянный капилляр без дозирования, объем крови в полном капилляре составляет примерно 30 мкл. Плазма для фотометрирования получается непосредственно в капилляре на любой гематокритной центрифуге. Правильность измерений прибора производится автоматически по встроенному цветному стеклу перед каждым измерением. Результат измерения может быть выведен на специальное печатающее устройство УП-02 «НПП-ТМ» или на компьютер. Единицы измерения: мкмоль/л. Диапазон измерения концентрации общего билирубина крови: от 0 до 500 мкмоль/л с относительной погрешностью 3% и абсолютной погрешностью 4 мкмоль/л в диапазоне от 0 до 150 мкмоль/л. Время фотометрирования: 2 секунды. Капилляры, входящие в комплект прибора гепаринизированы, но не стерильны и должны быть обработаны соответствующим образом в сухожаровом шкафу. Производитель используемых в этом приборе капилляров - фирма "Прецизионное стекло". В комплект поставки рекомендуется включать набор стеклянных мер оптической плотности НОСМОП-9, предназначенный для поверки анализаторов Билимет К.
На рынке также представлен цифровой анализатор билирубина серий BR (Apel, Япония), предназначенный для быстрого измерения общего билирубина в капилляре. Диапазон измерений составляет от 0 до 30 мг/дл (или от 0 до 513 мкмоль/л), объемом пробы 50-60 мкл и точностью измерения 5%. Память прибора позволяет хранить результаты измерений 99 проб. Прибор позиционируется для использования не только для диагностики неонатальной желтухи, но и в биохимических и клинических лабораториях (заболевания печени, гепатиты), хирургии (трансплантация печени), в экстренной медицине (для определений лекарственной, наркотической, алкогольной интоксикации) и т.д.
Неоспоримым преимуществом билирубинометров последнего поколения является отсутствие необходимости забора венозной крови для исследования. Определение общего билирубина прямым фотометрическим методом чрезвычайно просто, удобно, не требует венепункции (исследуется капиллярная кровь), может повторяться неоднократно в течение суток.
Преимущества Билирубинометра GB13-B
Билирубинометр последнего поколения GB13-B является лабораторным прибором для фотометрического анализа общего билирубина в сыворотке крови, которая помещена в гепаринизированный капилляр диаметром 1,58 мм. Результаты измерения могут быть выражены в мг/дл либо в мкмоль/л (пересчёт единиц: мг/дл х 17,1 => мкмоль/л). Влияние гемоглобина исключается. Время измерения составляет 5 секунд. Источник света – светодиод.
Современный компактный прибор позволяет проводить измерения концентрации билирубина от 0 до 30 мг/дл с высокой точностью ± 0.5 мг/дл при концентрации в диапазоне 3÷ 20 мг/дл и ± 1,0 мг/дл при концентрации в диапазоне 21÷ 30 мг/дл.
Управление осуществляется с помощью мембранной клавиатуры и цифрового дисплея на жидких кристаллах. Для регистрации информации в приборе есть встроенный принтер и порт RS232 для связи с компьютером.
В памяти прибора хранятся результаты измерений 96 пациентов (до 128 результатов для каждого пациента). Электронная система отмечает дату и время проведения измерения. Дополнительную надежность в работе прибора обеспечивает батарея автономного питания.
Единственный расходный материал – капилляры с антикоагулянтом. Специальные жидкости и дополнительные расходные материалы не требуются. Использование капилляров минимизирует ошибки, связанные с человеческим фактором и устраняет необходимость использования и мытья кювет после каждого измерения. Емкость капилляра: 60 мкл.
Одноразовый капилляр заполняется кровью пациента, центрифугируется для осаждения эритроцитов и помещается в держатель, после чего выполняется измерение, которое вместе с обработкой результата занимает не более 8 секунд.
Калибровка прибора стабильна, достаточно выполнять калибровку раз в 4 месяца. Для калибровки применяются эталонные растворы билирубина. Данная процедура защищена паролем и выполняется только авторизированным персоналом.
Простота и надежность процедуры исследования позволяет проводить определение билирубина не только в лаборатории, но и непосредственно в неонатальном отделении. Эффективно использование прибора для динамичного наблюдения за детьми с разными формами гипербилирубинемии, когда есть необходимость проведения многократных исследований и наблюдения динамики процессов. Отсутствие необходимости точного дозирования упрощает пробоподготовку, одновременно повышая точность и воспроизводимость исследований. Таким образом, решается вопрос о стандартизации проводимых измерений.
Варианты исполнения Билирубинометра GB13-B
Билирубинометр GB13B выпускается в четырех вариантах исполнения:
- GB 13B (a) - Базовая модель, без встроенных батареи и принтера
- GB 13B (a) st - Модель со встроенным принтером, без встроенной батареи
- GB 13B (b) - Модель со встроенной батареей, без встроенного принтера
- GB 13B (b) st - Модель со встроенной батареей и встроенным принтером.
Область использования Билирубинометра GB13-B
Благодаря простоте и надежности в использовании, билирубинометры серии GB13B рекомендуется использовать в отделениях неонатологии, родильных домах и автомобилях скорой помощи для перевозки новорожденных. Работа на приборе не требует длительного обучения и наличия специальных навыков у персонала.
Билирубинометр GB13-B соответствует всем современным требованиям медицинской практики, по результатам сравнения основных характеристик работы (точность определения концентрации билирубина, возможность хранения результатов измерений в памяти прибора, возможность передачи данных на компьютер, процедура калибровки прибора, наличие резервного питания и т.п.) является лидером на мировом рынке, надежен и удобен в эксплуатации, позволяет с высокой точностью и воспроизводимо проводить определение общего билирубина плазмы с использованием малых объемов капиллярной крови, что позволяет стандартизировать эту процедуру.
Билирубинометр GB13-B отвечает своему назначению и должен быть рекомендован к широкому клиническому применению, подразумевая оснащение всех родильных домов, перинатальных центров и отделений для новорожденных и недоношенных детей детских больниц.
Ближайший и единственный отечественный аналог билирубинометра GB-13B – это прибор ЗАО НПП «Техномедика» Билимет, уступающий как в точности определения билирубина, так и сложности калибровки прибора, удобстве наблюдения динамики и возможности сохранения результатов измерений.
ОХРАНА ЗДОРОВЬЯ МАТЕРИ И РЕБЕНКА в России
В Государственной программе развития здравоохранения Российской Федерации сформулированы основные приоритеты развития отрасли и отражены основные подходы к решению основополагающих вопросов, в том числе совершенствование инфраструктуры здравоохранения, формирование единой профилактической среды, повышение качества оказываемой медицинской помощи. Реализация мероприятий Госпрограммы рассчитана на период с 2013 по 2020 год и должна быть осуществлена в два этапа, при этом первый этап планируется завершить в 2015 году. Государственная программа включает в себя 11 подпрограмм, в числе которых выделены «Развитие и внедрение инновационных методов диагностики и лечения» и «Охрана здоровья матери и ребенка».
В Российской Федерации функционируют 76’203 акушерские койки, в том числе 39’461 койка для беременных и рожениц и 36’742 койки патологии беременности. Число родов в Российской Федерации в 2012 году составило 1’863’439 родов.
В 2011–2012 гг. в субъектах РФ осуществлялась реструктуризация сети учреждений родовспоможения. Мероприятия по оптимизации акушерского коечного фонда проводились с учетом числа родов, дифференцированного показателя длительности пребывания на койке в зависимости от группы учреждений родовспоможения, а также, использования коечного фонда федеральных учреждений. В результате количество акушерских стационаров I группы сократилось на 96 и в 2012 г. составило 1225, число акушерских стационаров II группы уменьшилось с 694 в 2010 г. до 641 в 2012 г, однако число акушерских стационаров III группы возросло и составило в 2010 г. 96, в 2012 г. – 115). Это произошло как за счет открытия новых перинатальных центров, так и за счет дооснащения и приведения акушерских стационаров II группы в соответствие с требованиями к учреждениям родовспоможения III группы. Таким образом, общее число акушерских стационаров официально на 2012 год составляло 1981 стационар ("Здравоохранение" № 11, 2013. Е.Н. Байбарина и др., Департамент медицинской помощи детям и службы родовспоможения Минздрава России), при этом в интернете сейчас уже можно найти более сорока тысяч отзывов о 739 роддомах России
Работа перинатальных центров и развитие перинатальной помощи – это огромный резерв в повышении качества медицинской помощи матерям и детям. В каждом крупном субъекте
Российской Федерации (6 тыс. родов и более) должен быть перинатальный центр, являющийся учреждением третьей (высшей) группы оказания помощи и оснащенный высокотехнологичным медицинским оборудованием, наиболее квалифицированными медицинскими кадрами для оказания медицинской помощи самому сложному контингенту пациентов.
В рамках приоритетного национального проекта "Здоровье" были введены в эксплуатацию в 2010 - 2012 годах 23 перинатальных центра, из них 22 региональных (Республика Мордовия, Забайкальский, Краснодарский, Красноярский и Пермский края, Амурская, Волгоградская, Воронежская, Иркутская, Калининградская, Кемеровская, Кировская, Курганская, Курская, Мурманская, Ростовская, Рязанская, Саратовская, Свердловская, Тверская, Томская и Ярославская области) и один федеральный - в г. Санкт-Петербурге. Ввод в эксплуатацию федерального перинатального центра в г. Москве планируется в 2015 году.
В настоящее время в Российской Федерации функционируют 98 перинатальных центров, в том числе 58 самостоятельных и 40 в составе многопрофильных больниц.
Недавно была принята Программа развития перинатальных центров в России, в соответствии с которой планируется построить еще 32 перинатальных центра в 30 регионах (Республике Башкортостан, Республике Бурятия, Республике Дагестан, Республике Ингушетия, Республике Карелия, Республике Саха (Якутия), Республике Хакасия, Кабардино-Балкарской Республике, Алтайском, Краснодарском, Красноярском (2 центра) и Ставропольском краях, Архангельской, Белгородской, Брянской, Калужской, Ленинградской, Липецкой, Московской (2 центра), Нижегородской, Оренбургской, Пензенской, Псковской, Самарской, Сахалинской, Смоленской, Тамбовской, Ульяновской и Челябинской областях, а также в г. Москве (новая территория). Программа направлена на дальнейшее улучшение демографической ситуации в Российской Федерации и укрепление здоровья населения.
24.07.2014
